截至目前，ELISA方法仍是工藝監(jiān)測和產品批次放行中檢測并定量HCP的金標準。Cygnus提供HCP 檢測試劑盒已經超過25年，開發(fā)了許多專利方法生產對HCP具有廣泛反應性的抗體，目前提供超過32種不同的表達平臺的HCP ELISA檢測試劑盒。
Cygnus的ELISA試劑盒使用預包被板，檢測同時加入抗原與檢測抗體進行孵育。HCP檢測實際上相當復雜，主要依賴于能夠對數千種HCP產生反應的HCP抗體，要使 ELISA檢測的結果準確，針對抗原的捕獲和檢測抗體必須都要過量。只有在抗體過量的條件下，才能得到正斜率的劑量曲線，從而實現準確的定量。因此，合理的孔板布局設置是一個很好的開始。
Cygnus HCP ELISA檢測基本流程
一、HCP ELISA布板規(guī)范
1. 復孔要求
推薦采用三復孔設計，三個復孔是最有效的做法，可以發(fā)現并去除可能出現的異常值，在完成實驗后做問題排查時能提供更多信息。需要注意的是，如果檢測樣品數量不支持設置三復孔，那么最少要設置雙復孔，沒有復孔的檢測是無效的。如果可以的話，最好對標準品和對照品設置三復孔。
2. 空白對照
不建議設置額外的空白對照，扣除空白對照不會改善實驗結果，甚至還會導致CV值升高。詳情請參考《使用Cygnus ELISA試劑盒該如何設置空白對照？》。
3. 設置陽性對照。
使用處于標準曲線中間濃度范圍的標準品作為陽性對照（低濃度標準品受靈敏度影響較大）。當使用來自HCP標準品的陽性對照時，曲線中間的濃度點通常會提供最多的信息。
4. 設置陰性對照
使用樣品稀釋液作為空白對照，從而評估0濃度標準品與所使用的稀釋液之間是否存在顯著偏差。
5. 設置1-2個額外的HCP對照
可以使用工藝流程中的一個已經過充分表征的在制品樣品作為額外的HCP對照。有富余孔的條件下，設置兩個稀釋度會比只有一個稀釋度效果更好。
6. 使用低結合板優(yōu)化加樣步驟
在向孔板加樣時，最重要的是要思考完成每一步驟需要多長時間，每一步驟的移動方向是什么。對于這種情況，預先將待檢樣品和酶標二抗加入低結合板內，然后再整個轉移到檢測孔板中，這樣能夠大幅減少將樣品添加到檢測板時造成的加樣誤差。
二、ELISA布板示例
樣品布板的最佳方式是將標準品置于板的左側，將對照品（陰性或陽性對照）置于板的右側，同時還要考慮需要設置的復孔數量，樣品稀釋梯度，以及在加樣和洗板時的移動方向。將標準品和質控品分別置于板的兩側，確保可以從孔板的任意一側都能獲取相同的信息。這樣能夠清晰地反映出在加樣時或洗板過程中可能出現的任何操作失誤，而且通過改變這些孔在板內的位置能夠更好地進行問題排查。
- 三復孔布板推薦示意圖
5個樣品4個稀釋梯度，所有標準品、樣品及對照品都設置三個復孔
- 雙復孔布板推薦示意圖
4個樣品和加標控制品都設置4稀釋梯度，所有標準品、樣品及對照品都設置雙復孔
- 未知濃度HCP樣品布板推薦示意圖
4個樣品8個稀釋梯度，以便收集未知HCP水平樣品的大部分信息。
更多布板示例文末獲取。
三、HCP ELISA布板常見問題排查及解決辦法
1. 加樣問題
在HCP ELISA檢測過程中，每2分鐘的靜態(tài)孵育相當于1分鐘的震蕩孵育。也就是說，如果加樣耗費了20分鐘，就相當于最先加入的樣品比最后加入的樣品多孵育了10分鐘。假如震蕩孵育的時間為1個小時，而加樣就花費了20分鐘，那么勢必會導致前后加入的樣品結合效率有差異，結果表現為最先加入的樣品會得到偏高的OD值。因此，加樣的原則是要確保板內所有孔的孵育時間盡可能一致。如果一次需要檢測的樣品數量較多，為了避免在加樣過程耗費太多時間，我們建議先將樣品和酶標抗體加入低結合板中，然后再用排槍快速轉移到檢測板內。實踐證明，這種操作方法可以有效改善因加樣時間差而導致的結果異常問題。
2. 洗板問題
不合理的洗板操作也會導致檢測結果的異常，與加樣操作類似，HCP ELISA洗板需要遵循的核心原則就是交替方向洗板，也就是盡可能確保所有孔的總清洗時間一致。關于洗板操作的注意事項請參考《如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測結果漂移的問題？》
四 常見錯誤案例與改進辦法
案例一 加樣緩慢造成的誤差
如果同一個樣品依次從A到H行，按照1到12列方向逐孔緩慢加樣，即使采用了正確的洗板方式，這種加樣方式也會對檢測結果產生影響。以下熱圖示例展示了如果將相同的樣品以緩慢的速度加入孔板會發(fā)生的情況。
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1 |
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3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
1.000 |
0.976 |
0.952 |
0.928 |
0.904 |
0.880 |
0.856 |
0.832 |
0.808 |
0.784 |
0.760 |
0.736 |
|
B |
0.997 |
0.973 |
0.949 |
0.925 |
0.901 |
0.877 |
0.853 |
0.829 |
0.805 |
0.781 |
0.757 |
0.733 |
|
C |
0.994 |
0.970 |
0.946 |
0.922 |
0.898 |
0.874 |
0.850 |
0.826 |
0.802 |
0.778 |
0.754 |
0.730 |
|
D |
0.991 |
0.967 |
0.943 |
0.919 |
0.895 |
0.871 |
0.847 |
0.823 |
0.799 |
0.775 |
0.751 |
0.727 |
|
E |
0.988 |
0.964 |
0.940 |
0.916 |
0.892 |
0.868 |
0.844 |
0.820 |
0.796 |
0.772 |
0.748 |
0.724 |
|
F |
0.985 |
0.961 |
0.937 |
0.913 |
0.889 |
0.865 |
0.841 |
0.817 |
0.793 |
0.769 |
0.745 |
0.721 |
|
G |
0.982 |
0.958 |
0.934 |
0.910 |
0.886 |
0.862 |
0.838 |
0.814 |
0.790 |
0.766 |
0.742 |
0.718 |
|
H |
0.979 |
0.955 |
0.931 |
0.907 |
0.883 |
0.859 |
0.835 |
0.811 |
0.787 |
0.763 |
0.739 |
0.715 |
改進辦法：預先在低結合板中加入酶標抗體和樣品，之后再用排槍將所有樣品快速轉移到檢測板中進行孵育。這樣可以有效減少不同孔加樣的時間差，確保所有孔的孵育時間盡可能一致，進而降低異常值出現的概率。
案例二 同一個方向洗板造成的誤差
如果4次洗板都是同一個方向加入洗液的話，也會對檢測結果造成影響。以下熱圖示例展示了4次洗板都是用排槍按照1到12列加入洗液可能發(fā)生的情況。
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
B |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
C |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
D |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
E |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
F |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
G |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
H |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
改進辦法：建議采用交替方向的方式洗板，也就是第1和3次洗板與第2和4次洗板要從相反的方向加入洗液。
五 HCP ELISA結果異常案例與問題排查
如下圖所示，該檢測結果樣品復孔之間出現自左向右的降低的趨勢，且孔板右側的陰性對照和陽性對照的OD值都比左側低。通過兩側陽性對照結果不一致可以判定此次實驗是失敗的。此外，左側陰性對照復孔之間OD值的平均差異為0.01，而右側陰性對照的OD值則接近背景水平，因此還需更多信息來進一步判斷問題來自加樣還是洗板。
綜上所述，本次實驗失敗的原因可能為：1、加樣太慢；2、洗板沒有交替方向的操作。
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
STD 1 |
Sample 1 Dilution 1 |
Sample 3 Dilution 1 |
Sample 5 Dilution 1 |
||||||||
|
B |
STD 2 |
Sample 1 Dilution 2 |
Sample 3 Dilution 2 |
Sample 5 Dilution 2 |
||||||||
|
C |
STD 3 |
Sample 1 Dilution 3 |
Sample 3 Dilution 3 |
Sample 5 Dilution 3 |
||||||||
|
D |
STD 4 |
Sample 1 Dilution 4 |
Sample 3 Dilution 4 |
Sample 5 Dilution 4 |
||||||||
|
E |
STD 5 |
Sample 2 Dilution 1 |
Sample 4 Dilution 1 |
Negative Control (Diluent) |
||||||||
|
F |
STD 6 |
Sample 2 Dilution 2 |
Sample 4 Dilution 2 |
Control Dilution 1(External HCP) |
||||||||
|
G |
STD 7 |
Sample 2 Dilution 3 |
Sample 4 Dilution 3 |
Control Dilution 2 (External HCP) |
||||||||
|
H |
STD 8 |
Sample 2 Dilution 4 |
Sample 4 Dilution 4 |
Postive Control (STD 5 repeat) |
||||||||
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
2.500 |
2.450 |
2.400 |
1.200 |
1.150 |
1.100 |
2.000 |
1.950 |
1.900 |
1.700 |
1.650 |
1.600 |
|
B |
1.200 |
1.150 |
1.100 |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
1.000 |
0.950 |
0.900 |
0.850 |
0.800 |
0.750 |
|
C |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
0.300 |
0.280 |
0.260 |
0.500 |
0.480 |
0.460 |
0.425 |
0.405 |
0.385 |
|
D |
0.300 |
0.250 |
0.200 |
0.150 |
0.140 |
0.130 |
0.250 |
0.240 |
0.230 |
0.212 |
0.202 |
0.192 |
|
E |
0.150 |
0.130 |
0.110 |
1.400 |
1.350 |
1.300 |
0.125 |
0.115 |
0.105 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
|
F |
0.075 |
0.065 |
0.055 |
0.700 |
0.650 |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
0.450 |
0.230 |
0.225 |
0.220 |
|
G |
0.038 |
0.033 |
0.028 |
0.350 |
0.330 |
0.310 |
0.290 |
0.270 |
0.250 |
0.115 |
0.095 |
0.075 |
|
H |
0.015 |
0.010 |
0.005 |
0.175 |
0.165 |
0.155 |
0.145 |
0.135 |
0.125 |
0.090 |
0.080 |
0.070 |
總結
? 在ELISA實驗之前應該合理規(guī)劃孔板布局：優(yōu)化的孔板布局能夠監(jiān)測關鍵性能指標，并在出現問題時更快地進行問題排查。更多布板示例請點擊這里獲取。
? HCP ELISA的關鍵考慮因素包括：復孔設置、樣品稀釋梯度、加樣和洗板的操作、對照的設置。
? 用低結合板來優(yōu)化加樣操作，可以最大程度減少OD值的偏差。
? 切勿使用空白對照，這樣做會提高檢測結果的變異系數。
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品名：Sample Treatment Plate （樣品處理板）
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規(guī)格：1 plate
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北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關系。多年來西美杰的產品及服務幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產品上市時間，降低QC成本。如您對上述產品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網站www.emergexcelerate.com了解更多信息。
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